凝胶电泳法检测内毒素

凝胶电泳法

当将含有细菌内毒素的溶液与裂解物混合后进行孵育时,方法A和B取决于牢固凝胶的形成。方法A作为极限测试进行,其中受检制剂的两种重复溶液中所含的内毒素的浓度均应低于各论中规定的内毒素极限浓度。方法B半定量测定所检查制剂中的内毒素浓度。
 

裂解液的敏感性

在测试中使用每批裂解物至少一个小瓶之前,请确认每批新裂解物的标记灵敏度。准备一系列的CSE稀释液,使浓度分别为2λ,λ,0.5λ和0.25λ,其中λ是裂解液在EU中每毫升的标记灵敏度。对这四个标准浓度一式两份,按照方法给出的方法进行测试,并包括由水BET组成的阴性对照。至少每个系列中的**终稀释液**给出阴性结果。

计算在发现阳性结果的每个稀释系列中**低内毒素浓度的对数平均值。几何平均终点浓度是裂解液的测量灵敏度,以ED / ml为单位,可使用以下表达式计算:

几何平均终点浓度=反对数(∑e / f)
其中,∑e =对数之和使用的一系列稀释液的终点浓度
f =复制试管的数量。
该平均值给出了估计的裂解物敏感性,**在0.5λ和2λ之间。

测试干扰因素

应牢记某些因素干扰细菌内毒素测试的可能性。为了验证测试结果,**证明测试制剂不会抑制或增强反应或以其他方式干扰测试。的验证如果裂解物的供应商或制造或样品的制剂的方法改变**被重复。
用水BET稀释测试制剂是克服抑制作用的**简单方法。

允许的稀释水平或**大有效稀释度(MVD)取决于产品的浓度,产品的内毒素极限和裂解物的敏感性。它由以下表达式计算:

MVD =内毒素极限x测试溶液的浓度
凝胶凝结法-浓缩                                                        λ
准备测试溶液。如表中所示准备溶液A到D的重复样品。
 
溶液A =稀释度等于或低于MVD的产品溶液(测试溶液)。
溶液B =加标有指定CSE浓度的测试溶液(正产品控制; PPC)。
溶液C =在水BET中具有指示的CSE浓度的标准溶液。
溶液D =水BET(阴性对照; NC)。

方法 

在试管,小瓶或微量滴定板孔等容器中实行以下步骤。在每个选定的容器中,添加适量的阴性对照(NC),水BET中的标准CSE溶液,测试溶液和阳性产品对照(PPC)。除非使用单个测试瓶,否则应间隔一定时间以允许读取每个结果,向每个容器中添加等体积的适当构成的裂解液。轻轻地混合样品裂解物混合物,然后放置在诸如水浴或加热块的培养装置中,准确记录放置容器的时间。将每个容器在不受干扰的37°±10孵育60±2分钟。取下容器并仔细检查内容物。

 
将此结果记录为正(+)。阴性结果的特征是不存在这种凝胶或形成不保持其完整性的粘性凝胶。将这样的结果记录为负(-)。小心处理容器,避免使它们遭受不必要的振动,因为可能导致错误的负面观察。

通过使用在裂解物敏感性下描述的公式,计算C带系列溶液的几何平均终点浓度。

计算和结果说明

如果
(a)系列A和D的解决方案给出否定的结果,则干扰因素的检验是有效的;
(b)用C系列溶液获得的结果证实了裂解物的标记灵敏度;
(c)B系列溶液终点浓度的几何平均值不大于21或不小于0.51。

如果获得的结果超出规定的范围,则所检测的测试制剂将充当抑制剂或活化剂。可以通过进一步稀释(不超过MVD),过滤,中和,灭活或通过去除干扰物质来消除干扰因素。使用更敏感的裂解液可以对所检查的制剂进行更大的稀释。如果干扰因素通过标称分离极限的分子量对应于10,000到20,000的过滤器,例如三乙酸纤维素的不对称膜过滤器,则可以使用超滤。 
 
应该检查这种过滤器是否存在任何导致假阳性结果的因素。用水BET或pH 7.4 BET的三氯化物缓冲液冲洗保留在过滤器上的含有内毒素的物质。内毒素在水BET或缓冲液中回收。确定每种待测制剂的测试体积和**终体积中的内毒素浓度。

通过使用添加了CSE并已提交给所选治疗方法的待测制剂,通过重复进行干扰因子测试,确定所选治疗方法可有效消除干扰,而不会去除内毒素。

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